Cell Death Dis︱邹飞/蔡绍曦/周良团队合作揭露肝细胞癌发展的新机制
撰文︱刘幸源
责编︱方以一，王思珍
编辑︱方以一
肝细胞癌（hepatocellular Carcinoma，HCC）是肝癌的主要组织学亚型，占原发性肝癌的90%，具有高死亡率的特点，五年生存率仅为18%，排在胰腺癌之后为世界第二致死性肿瘤[1]。全球范围内，HCC每年造成746,000人死亡，并且预计到2030年每年死于HCC人数将超过100万人[2, 3]。HCC在无肝病基础的患者中极少出现，其发病机制主要为病毒感染及长期慢性炎症导致肝细胞异常增生及纤维化，最终发展成为癌前病变——发育不良结节。同时，病毒感染及慢性炎症所致肝细胞内分子改变使肝异常细胞免于免疫细胞的捕捉、具备异常增殖及迁移能力，最终完成向肝细胞癌细胞的转变[4]。尽管如今已存在多种治疗方法，但患者早、中期症状相对较轻，不易察觉，诊断时往往已经为晚期，致使HCC病死率仍然居高不下[5]。因此，深入了解HCC发病机制，发现细胞中异常变化的分子，以此为靶点进行干预治疗，能够为HCC的治疗提供新的思路，提高患者生存率。
2022年7月23日，南方医科大学公共卫生学院邹飞教授、周良教授及南方医院呼吸科蔡绍曦教授课题组在Cell Death & Disease发表了题为“SALIS transcriptionally represses IGFBP3/Caspase-7-mediated apoptosis by associating with STAT5A to promote hepatocellular carcinoma”的研究。该研究通过转录组测序及质谱分析，首度阐明了长链非编码RNA SALIS在HCC发展中的作用，并找出了其背后的分子机制。同时，本研究同样首度发现了HCC中STAT5A对IGFBP3和Caspase-7的转录调控作用，并发现了一个全新的SALIS/STAT5A/IGFBP3/Caspase-7调控轴来调节HCC的细胞凋亡。
首先，作者通过GEO数据库及TCGA数据库分析发现LncRNA SALIS 在HCC中表达水平显著高于正常肝组织（图1a, b），之后在临床组织样本、组织芯片及HCC细胞系中进行了验证（图1c-f）。确认SALIS在HCC中表达水平显著高于正常肝组织，且随着HCC临床分期的提高其表达有逐渐增加的趋势。
图1 SALIS在HCC中高表达
（图源：Liu XY, et al., Cell Death Dis, 2022）
之后，作者敲减SALIS后进行了功能实验及转录组测序，并对测序结果进行富集分析，主要富集到多个凋亡相关通路及胰岛素样生长因子相关通路，包括“cysteine-type endopeptidase activity involved in apoptotic process”、“cysteine-type peptidase activity”、“cysteine-type endopeptidase activity”、“insulin-like growth factor I binding”、“protein phosphatase activator activity”、“endopeptidase activity”、“execution phase of apoptosis”、“positive regulation of insulin-like growth factor receptor signaling pathway”、“Necroptosis”和“Apoptosis-multiple species” 其中包括半胱氨酸蛋白酶7（Caspase-7）及胰岛素样生长因子结合蛋白3（IGFBP3）两个显著上调基因（图2a-c）。Caspase-7为凋亡通路中的关键执行蛋白，能够被上游Caspase激活并剪切激活底物蛋白，从而引起细胞凋亡。IGFBP3在血浆中参与调节胰岛素样生长因子相关通路，在细胞内则被证明能够诱导多种癌症细胞的细胞凋亡。
图2 敲减SALIS后RNA-seq富集分析
（图源：Liu XY, et al., Cell Death Dis, 2022）
作者之后通过Western blot及RT-qPCR实验对测序结果进行了验证。同时使用流式细胞术检测敲减SALIS后细胞的凋亡。结果显示，敲减SALIS使IGFBP3和Caspase-7的蛋白质及RNA水平显著提高，BAX、cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-7蛋白量增加，细胞凋亡水平上调。而在敲减SALIS的同时敲减IGFBP3或Caspase-7能够使cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-7蛋白量下降，细胞凋亡水平降低（图3g-i，图4f-h）。
图3 双敲SALIS及IGFBP3后Western blot、RT-qPCR及流式细胞术结果
（图源：Liu XY, et al. Cell Death Dis. 2022）
图4 双敲SALIS及Caspase后Western blot、RT-qPCR及流式细胞术结果
（图源：Liu XY, et al., Cell Death Dis, 2022）
由于LncRNA对基因的转录调控主要由其与转录因子相互作用来完成，作者通过RNA pull-down富集到与SALIS作用的蛋白质，进行高效液相色谱串联质谱分析，找到了在HCC中显著上调的转录因子STAT5A。通过数据库预测，作者确认了STAT5A与IGFBP3和Caspase-7启动子区域结合的潜在位点，通过ChIP实验证明了STAT5A能够与IGFBP3和Caspase-7启动子区域特异性结合。之后又通过ChIRP实验证明了SALIS也能够与IGFBP3和Caspase-7启动子区域特异性结合（图5b-j）。
图5 SALIS与STAT5A相互作用，特异性结合在IGFBP3和Caspase-7启动子区域
（图源：Liu XY, et al., Cell Death Dis, 2022）
同时，Western blot、RT-qPCR及流式细胞术实验结果显示，敲减STAT5A能够使IGFBP3和Caspase-7的蛋白质及RNA水平显著提高，BAX、cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-7蛋白量增加，细胞凋亡水平上调。敲减SALIS的同时敲减STAT5A能够使BAX、cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-7蛋白量进一步提高，细胞凋亡水平进一步上升（图6a-e）。
图6 SALIS对IGFBP3和Caspase-7表达及细胞凋亡的抑制依赖于STAT5A
（图源：Liu XY, et al., Cell Death Dis, 2022）
最后，作者通过裸鼠移植瘤模型在体内验证了SALIS在HCC中的癌基因作用。SALIS敲减的HCC细胞所形成的移植瘤的生长速度明显变慢及肿瘤体积变小。同时，敲减SALIS能够使IGFBP3、Caspase-7、BAX、cleaved Caspase-3及cleaved Caspase-7蛋白量不同程度上升（图7a-f）。
图7 裸鼠移植瘤模型中SALIS缺失促进细胞凋亡，抑制肿瘤生长
（图源：Liu XY, et al., Cell Death Dis, 2022）
图8 SALIS与STAT5A相互作用，抑制IGFBP3和Caspase-7转录，从而抑制凋亡
（图源：Liu XY, et al., Cell Death Dis, 2022）
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41419-022-05094-z
通讯作者：邹飞（左一）、蔡绍曦（左二）、周良（右二）；第一作者：刘幸源（右一）
（照片提供自： 邹飞/蔡绍曦/周良团队）
通讯作者简介：（上下滑动阅读）
通讯作者：邹飞，南方医科大学公共卫生学院职业卫生与职业医学系，二级教授，博士研究生导师/博士后合作导师，国家级教学名师，享受国务院政府特贴。研究方向：1. 热应激、热损伤与热耐受的分子机制研究；2. Hsp90对氧化应激信号转导通路的调控作用研究
通讯作者：蔡绍曦，南方医科大学南方医院呼吸内科，二级教授/主任医师，博士研究生导师/博士后合作导师。研究方向：疑难危重呼吸系统疾病的临床救治，主要研究方向为慢性气道疾病的临床与应用基础研究、气道和肺纤维化的临床与应用基础研究。
通讯作者：周良，南方医科大学公共卫生学院毒理学系，教授，博士研究生导师/博士后合作导师。研究方向：细胞应激的分子毒理学机制，包括药化毒理学、放射毒理学和肿瘤分子毒理等领域，主要研究在化学、物理因素诱导细胞应激条件下，LncRNA和应激调控相关因子在内质网应激、低氧应激、糖代谢、细胞凋亡与自噬等进程中的分子毒理学机制，重点关注LncRNA介导的关键节点蛋白修饰的变化对重要信号传导通路和细胞命运决定的影响。研究方向：1. LncRNA介导的蛋白修饰在应激条件下影响肿瘤细胞命运决定中的调控机理；2. 药物或毒物引起细胞应激的信号传导和细胞命运决定机制；3. 电离辐射所致细胞应激的分子毒理学机制。
第一作者：刘幸源，硕士毕业于南方医科大学公共卫生学院职业卫生与职业医学系，博士在读香港中文大学医学院化学病理系。
【1】Nat Rev Immunol 综述 | 赵阳等评述衰老相关炎症中的DNA损伤和修复
【2】Nat Commun︱孙良丹团队揭示CaMK4在银屑病中的作用机制
【3】Cell Death Dis 综述︱袁富文/房孝生/William Hankey课题组系统总结前列腺癌AR靶向治疗最新进展和挑战
【4】Cell Death Dis ￜ 郭志刚/殷志敏/潘飞燕团队揭示DNA损伤修复蛋白在类风湿关节炎中的重要作用及发病机制
【5】Mol Ther︱高宗良等构建缩短版的先导编辑器，助力先导编辑系统体内呈递
【6】EMBO Rep︱陈允梓课题组揭示维生素D受体调控NLRC4炎症小体新机制
【7】Nat Commun︱贾鑫明/瞿介明团队发现新型隐球菌感染免疫抑制新机制及潜在治疗靶点
【8】Cell Death Dis︱李志远团队发现干细胞疗法或将成为治疗脊髓小脑性共济失调（SCA）的新希望
参考文献（上下滑动阅读）
[2] Villanueva A. Hepatocellular Carcinoma[J]. N Engl J Med, 2019, 380(15): 1450-1462.
[3] Parkin D M. Global cancer statistics in the year 2000[J]. Lancet Oncol, 2001, 2(9): 533-43.
[4] Torrecilla S, Sia D, Harrington A N, et al. Trunk mutational events present minimal intra- and inter-tumoral heterogeneity in hepatocellular carcinoma[J]. J Hepatol, 2017, 67(6): 1222-1231.
[5] Villanueva A, Hernandez-Gea V, Llovet J M. Medical therapies for hepatocellular carcinoma: a critical view of the evidence[J]. Nat Rev Gastroenterol Hepatol, 2013, 10(1): 34-42.
本文完